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薄层色谱法阅读:110

薄层色谱法(TLC),系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上,成一均匀薄层。待点样、展开后,根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比,用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术,也用于跟踪反应进程。

应用

  食品和营养
  食品中的营养成分是蛋白质、氨基酸、糖类、油和脂肪、维生素、食用色素等。与食品和营养有害的物质则有残留农药、致癌的黄曲霉素等。这些成分都可用薄层色谱法定性和定量。蛋白质和多肽水解为氨基酸,对不同来源的动物性和植物性蛋白水解后产生不同的氨基酸进行定性和定量,有助于解决蛋白质的结构和食品营养问题。二十多种氨基酸用硅胶G薄层板双向展开,一次即能分开,然后定性和定量,方法快速而简便。多糖和寡糖可水解为单糖,可用薄层色谱法进行单糖和双糖的定性和定量。文献上有每一个糖的Rf值和相应的展开剂。油和脂肪解为脂肪酸,脂肪酸的种类和结构中的不饱和键数,与营养和卫生有关,关于油和脂肪的薄层(硅胶、硅藻土、纤维素)分析,文献和综述很多。脂溶性和水溶性维生素在薄层上可方便地定性和定量,例如脂溶性维生素A,D,E,K及B2,B6,B12,酶酸,泛酸,叶酸,C,促生素在硅胶G薄层上可用苯:甲醇:丙酮:冰醋酸(7:2:0.5:0.5)分开。用硅胶G薄层和丙酮:氯仿(1:1)以及激发波长365nm和波长450nm,可用荧光法测定ng量的曲黄素B1,B2,G1,G2,法灵敏快速。
  药物和药物代谢
  薄层色谱法在合成药物和天然药物中的应用很广。有些文献和内容偏重于合成药物、化合物及其代谢产物,有文献为在中草药分析中的应用。每一类药物,例如磺胺、巴比妥、苯骈噻嗪、甾体激素、抗菌素、生物碱、强心甙、黄酮、挥发油和萜等,都包括几种或十几种化学结构和性质非常相似的化合物,可以在上述文献中找出一、二种全盘的展开剂,一次即能把每一类的多种化合物很好地分开。药物代谢产物的样品一般先经预处理后用薄层分析,应用也很广,但有时因含量甚微,不用采用气相和高效液相色谱法灵敏。
  化学和化工
  化工和化学方面的有机原料和产品都可用薄层色谱法分析。例如含各种功能基的有机物,石油产品,塑料单体,橡胶裂解产物,油漆原料,合成洗涤剂等,内容非常广泛。
  医学和临床
  薄层色谱法的应用还渗透到医学和临床中去,例如它是一种快速的诊断方法可用于妊娠的早期诊断。方法是基于在孕妇的尿中能检出比未媳妇妇女的尿中含更多的孕二醇,把两者的尿提取后点在薄层上比较,即可作出判断。这一方法可不用动物而在2~3小时内化验出结果。
  毒物分析和法医化学
  如前所述,经典的毒物分析有许多缺点,毒物分析和法医化学采用薄层色谱法等新的手段,对麻醉药、巴比妥、印度大麻、鸦片生物碱等均可分析。
  农药
  十多种有机磷农药和六种有机氯农药都可在硅胶G薄层上分开并测定含量,可用于农药分析及其残留量分析。

仪器材料

  1、载板
  用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料板,对薄层板的要求是:需要有一定的机械强度及化学惰性,且厚度均匀、表面平整,因此玻璃板是最常用的。载板可以有不同规格,但最大不得超过20×20,玻璃板在使用前必须洗净、干燥备用。玻板除另有规定外,用5cm×20cm,10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。
  2、固定相(吸附剂)或载体
  薄层层析硅胶薄层层析硅胶最常用的有硅胶G、硅胶GF〈[254]〉、硅胶H、硅胶HF〈[254]〉,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F〈[254]〉等。其颗粒大小,一般要求直径为10~40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂,一般常用10~15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5~0.7%)适量调成糊状,均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。
  3、涂布器
  应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
  4、点样器
  定性:内径为0.5mm管口平整的普通毛细管。
  定量:微量注射剂。
  点样直径不超过4mm,点样距离一般为1~1.5cm即可。
  5、展开室
  应使用适合载板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,除另有规定外,底部应平整光滑,应便于观察。

基本原理

  薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法,它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同,使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中,连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,从而达到各成分的互相分离的目的。
  薄层层析可根据作为固定相的支持物不同,分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
  吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面,吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上,都可能发生吸附现象。
  物质分子之所以能在固体表面停留,这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部,分子之间相互作用的力是对称的,其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的,向内的一面受到固体内部分子的作用力大,而表面层所受的作用力小,因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响,就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的,被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。
  例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开,则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定,同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

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