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激光显微镜(CLSM)由共聚焦显微镜和飞秒红外激光器Verdi/Mira两部分组成,是光学显微镜与现代激光技术,高灵敏探测技术,扫描控制技术以及微机图象处理技术,荧光及标记技术的结合。CLSM为生命科学开拓了一条观察生命活细胞的结构及特定分子、离子生物学变化的新途径,成为分子细胞生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
共聚焦及双光子在现代生物学研究中有如下应用:
1、多色荧光成像(Multi-color imaging),具有多磁道和双向扫描,曲线扫描等特性。
2、三维重构(Three dimentional reconstruction)及定量分析。
3、实时成像(Time series,real time imaging),可进行活细胞跟踪。
4、离子成像(Ion imaging)/比率成像(Ratio imaging),可进行Ca2+,Mg2+,H+,Na+,K+,Zn2+,Ni2+,Fe2+,Hg2+,Pb2+及Cd2+等成像。
5、荧光原位杂交(FISH:fluorescence in situ hybridization);
6、荧光漂白恢复(FRAP:fluorescence recovery after photobleaching);
7、荧光共振能量转移(FRETM:fluorescence resonance energy transfer;
8、光生命期成像显微术(FLIM:fluorescence lifetime imaging microscopy)。
9、荧光相关光谱(FCS:fluorescence correlation spectroscopy)。
1、荧光标记的特异性及可定量性。
2、共聚焦针孔的运用,有效的消除了焦平面上下散射光,提高轴向分辨率。
3、点光源激光的应用,对荧光素能达到有效的激发,激发的特异性高,降低对荧光的淬灭,增强侧向分辨率。
4、双光子的应用,相对较低平均功率的红外激发,大大减低对活细胞的损伤;荧光激发高度聚焦在焦点处,可避免了焦点以外的光漂白(Photobleaching)和光毒(cytotoxicity)作用,延长观察时间,是目前用于活细胞跟踪的最理想方法。
5、脉冲激光散射和吸收程度小,透射性强,对厚样品的穿透可达400um,是对厚的组织分析的最首先方法。
6、结合META新技术,尤其对荧光蛋白成像具有更方便,更精确的效果。