流式细胞仪阅读：473

　　流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

　　这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

　　检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

　　细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

　　（1）流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

　　（2）流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围，分辨率在最好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

　　（3）评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数（CV），对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品（荧光微球）和生物细胞样品（人淋巴细胞、鸡红细胞等） 。目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般<2%～3%。

　　由于该仪器比较昂贵且精密，操作人员使用不当就很容易使液流部位出问题，所以需要加强日常的保养工作。

　　1、所用溶液都要进行过滤处理，样本在上机前也要过滤，以免时间久了出现沉淀物而堵塞喷嘴。

　　2、开机后检测样本前，要用prime机检查喷嘴的畅通状况。

　　3、每日关机前移开托臂，用3～4管10%次氯酸钠反复冲洗，不要让有堵塞的喷嘴带病运行，使用经过滤处理的H2O或PBS冲洗后才关机。

　　4、每天要倒空废液瓶内的废液，再注入少量的次氯酸钠或消佳净溶液，以防细菌生长。

　　5、鞘液瓶内的液体加至4/5容量并放置一夜，防止新加入的液体有气泡产生而影响检测结果。

　　流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。

　　⑴、DNA倍体分析

　　DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。

　　⑵、细胞生存能力实验

　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。

　　流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片

　　⑶、计数外周血中检测网织红细胞

　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统

　　⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定

　　使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统

　　⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验

　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片

　　⑹、血小板自身抗体检测

　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片

　　⑺、移植交叉配型

　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。

　　仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片

　　⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应

　　淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。

　　流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片

　　⑼、检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）

　　1、仪器长时间不能进入ready状态

　　这种情况可能是试管有裂缝导致漏气、鞘液罐的接口漏气、喷嘴上的胶圈破损及老化，或电源部分有故障，都应逐个排除。如果按仁述方法也未能排除故障，需请厂家来维修。

　　2、喷嘴堵塞

　　该故障在操作中较多出现。日常的喷嘴在prime机时喷出一道水柱，如果喷出的是气泡，则说明喷嘴有堵塞，气泡越大堵塞越严重。

　　排除故障的步骤：①放开托臂，用10%的次氯酸钠反复冲洗再放回托臂机，如果故障还未排除就应关掉主机。②用的注射器接上胶管套，在喷嘴上反复抽吸，一般堵塞现象可以排除。③如果注射器抽吸无效，则要小自取下喷嘴。此操作最好由厂家的维修人员或熟练的工作人员进行，以免撞弯了喷嘴。喷嘴用注射器套上冲洗，直至喷嘴喷出的水柱呈直线为止。④如果喷嘴堵塞经上述淀查病后的水柱呈直线为止。④如果喷嘴堵塞经上述3个步骤还不能解决，可以用超声波仪清洗。清洗时喷嘴两头应套上试管，以防碰弯。先将喷嘴浸入的10%次氯酸钠中超声1h，然后用过滤后H2O的再超声1h，经过此步骤清洗的喷嘴都会消除堵塞现象。注意不到万不得己时不要拆下喷嘴清洗，因为反复的拆卸会增加喷嘴损坏的可能性。