PCR扩增仪阅读：21

　　根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。

　　1. 普通PCR仪

　　一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。

　　2. 梯度PCR仪

　　一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。梯度PCR仪在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。主要应用于科研、教学机构。

　　3. 原位PCR仪

　　用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪称作原位PCR仪。如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。主要应用于临床、科研。

　　4. 实时荧光定量PCR仪

　　在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统的PCR仪称作荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这种PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪（qPCR仪）。荧光定量PCR仪有单通道、双通道和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同目的基因片段的量。主要用于医学临床检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等机构。

　　根据DNA扩增时升温介质的不同可以将PCR仪分为：变温铝块式PCR仪、水浴式PCR仪和变温式流式PCR仪。

　　1. 变温铝块式PCR仪

　　热源用电阻丝、导电热膜、热泵式珀尔帖半导体元件制作，让带有凹孔的铝块升温，用自来水、制冷压缩机或半导体降温。优点：温度传导快，各管的扩增一致性好；反应管规格一致时无须外涂石蜡油；可用微电脑调节温度转换；仪器制冷部件可以在完成扩增后降温至4℃，保存样品过夜。缺点：管内反应液温度比铝块显示温度滞后；须使用特制且与铝块凹孔形状紧密吻合的薄壁耐热反应管；变温时难以快速克服铝块的热容量；压缩机制冷启动慢、重量大、滞后时间长。

　　2. 水浴式PCR仪

　　仪器本身有3个不同温度的水浴，用机械装置将带有反应管的架子移位和升降温度，使温度循环。优点：水为传热介质，温度易恒定，热容量大；反应管形状无特殊要求，温度转换较快扩增效果稳定；具有较高的运行效率，扩增产物特异性好。缺点：高温浴不稳定，水面需用液体石蜡覆盖；改变水浴温度所需时间较长，不易实施复杂程序（如套式PCR）的操作，仪器体积较大；室温影响温度下限。

　　3. 变温式流式PCR仪

　　依据空气流的动力学原理，以冷热气流为介质升降温度。优点：变温迅速，扩增效果好，适合于微量、快速PCR；反应器不受形状限制，管外无需涂液体石蜡；测定管内液体温度作为控温依据，显示温度真实可靠；易于用微电脑设定复杂的变温程序；易于制成重量较轻的便携式仪器，适合外出作业。缺点：以室温为温度下限，低温难控制，对空气流的动力学要求较高，需精心设计才能使各管温度均匀。

　　PCR技术的原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成 。

　　1. 模板DNA的变性

　　模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

　　2. 模板DNA与引物的退火(复性)

　　模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合。

　　3. 引物的延伸

　　DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

　　重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一轮循环需2-4分钟，如此反复进行，每一轮循环所产生的DNA均能成为下一轮循环的模板，每一轮循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增1倍，PCR产物以2的指数形式迅速扩增，经过25-30轮循环后(2-3小时)，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达10⁶-10⁷倍。

　　1.温度精度

　　温度精度是指PCR扩增仪设定温度与实际温度之间的差异。校准时需要确保温控系统能够精确地加热到设定的温度，误差通常应控制在±0.5°C或±1.0°C以内。

　　2.温度均匀性

　　不同区域的温度是否均匀，尤其是在多孔PCR扩增仪中，温差过大会影响扩增反应的结果。每个温区的温度差异应控制在±0.5°C以内。

　　3.温度梯度（适用于梯度PCR扩增仪）

　　梯度PCR扩增仪具有多温区功能，用于设置不同的退火温度。校准时需要验证各温区的温度差异，通常要求温区内的温差控制在±1.0°C以内。

　　4.加热/冷却速率

　　加热和冷却速率是指PCR扩增仪从一个温度转变到另一个温度所需的时间。常见的标准要求加热和冷却速率在1°C/s至3°C/s之间。

　　5.循环时间

　　指PCR扩增过程中每一轮循环的时间，包括变性、退火和延伸等步骤的持续时间。循环时间误差应小于±1秒。

　　一、设备准备

　　1.检查设备状态

　　确保PCR扩增仪通电并正常启动。检查温控系统是否正常工作，并确认设备没有异常噪音或错误信息。

　　2.加载耗材

　　根据实验需求，将PCR反应管或PCR板正确放入设备的样本架上，并确保孔位清晰标识。确保加热盖等部件能完全覆盖样本板。

　　二、设定PCR程序

　　1.打开软件

　　启动PCR扩增仪自带的软件（大多数PCR仪器都有专用的控制软件），并根据实验需求选择合适的PCR程序模板，或根据实际需要手动设置。

　　2.温度和时间设置

　　设置每个步骤的温度（如：95°C变性，60°C退火，72°C延伸等）。

　　设置每个步骤的持续时间（通常变性30秒，退火30秒，延伸时间根据扩增片段的长度而定）。

　　设置循环次数（通常25-40次）以及可能的梯度温控（适用于梯度PCR）。

　　三、启动和监控

　　1.启动扩增程序

　　设定好所有参数后，启动PCR扩增仪。设备将自动根据设定的程序进行加热、冷却及循环操作。

　　2.实时监控

　　根据设备类型，某些PCR仪器支持实时监控扩增反应，显示每个样本的实时荧光信号（如果是实时PCR仪）。如果是传统PCR仪器，通常不会显示实时数据，但可以通过设备的状态指示灯或界面看到温度变化。

　　四、实验后操作

　　1.结束和取样

　　PCR程序结束后，扩增仪会自动停止并保持温度。取出PCR反应管或PCR板时，注意避免烫伤。

　　2.后续操作

　　根据实验需求，可以直接进行凝胶电泳分析或其他后续分析，如定量PCR、克隆、测序等。

　　五、设备清洁和维护

　　1.定期清洁

　　定期清洁PCR扩增仪的外部及加热盖、样本架等部分。避免样本污染或加热元件过热。

　　2.温控系统检查

　　检查温控系统是否正常，必要时进行校准和维修。确保设备的稳定性。

　　3.数据保存和记录

　　实验结束后，保存设备运行数据和实验结果，并记录任何异常情况。

　　1.避免温度过高或过低

　　设定温度时应避免超出PCR扩增仪的工作范围，特别是在高温变性步骤，过高的温度可能会损伤样本或反应体系。

　　2.遵循样本和试剂的使用规定

　　确保PCR反应管、试剂和引物的正确使用，避免污染和实验误差。

　　3.设备维护

　　定期进行设备校准、维护和清洁，保持PCR扩增仪的长期稳定性。

　　一、温度控制不准确

　　1.检查

　　确认温度传感器是否工作正常，设备是否存在故障。

　　2.解决方法

　　如果发现温度偏差超出正常范围，应进行校准，必要时联系设备厂家维修。

　　二、加热/冷却速率过慢

　　1.检查

　　检查加热元件和冷却系统是否正常工作，是否存在过度积尘或故障。

　　2.解决方法

　　清洁加热元件，必要时联系厂家进行技术支持。

　　三、PCR反应结果不理想

　　1.检查

　　检查反应配方、样本质量和PCR仪器的温度设置是否正确。

　　2.解决方法

　　调整PCR程序、优化引物设计，确保样本的质量和PCR扩增条件的适宜性。